Od pomysłu do realizacji

Prawie 40 lat temu, w 1979 roku, Francis Crick, laureat Nagrody Nobla i odkrywca struktury molekularnej DNA, stwierdził, że głównym wyzwaniem, przed jakim staje neuronauka, jest opanowanie umiejętności kontrolowania jednego typu komórek w mózgu przy jednoczesnym pozostawieniu innych niezmienionymi (1). Mózgi kręgowców zawierają wiele rodzajów komórek, co sprawia, że jest to bardzo heterogenna sieć. Crick już wtedy sugerował, że czynnikiem zdolnym do szybkiej i precyzyjnej kontroli aktywności danego typu komórek może być światło. Klasyczne techniki, wykorzystywane do badania i kontrolowania funkcji mózgu, takie jak stymulacje elektryczne czy środki farmakologiczne mają znaczące ograniczenia – te pierwsze bowiem działają nieselektywnie na wszystkie typy komórek, natomiast drugie nie zapewniają potrzebnej szybkości. Dopiero dekadę temu to przypuszczenie udało się wcielić w życie. Tak powstała nowa metoda – optogenetyka.

Optogenetyka stanowi swoisty mariaż pomiędzy optyką i genetyką, mający na celu precyzyjne pod względem czasowym i przestrzennym manipulowanie aktywnością wybranych neuronów i innych komórek pobudliwych za pomocą światła oddziałującego na światłoczułe białka zlokalizowane na błonie komórkowej badanych komórek (1). Poszczególne typy światłoczułych białek reagują na  światło o charakterystycznej dla siebie długości i wywołując bądź to aktywację, bądź inhibicję danego zjawiska – np. przekazywania sygnału przez neurony. Co ważne zmienianie aktywności komórek docelowych nie niesie ze sobą reakcji ze strony sąsiadujących komórek, a eksperymenty przeprowadza się na normalnie funkcjonujących, żywych zwierzętach.

Kluczowe elementy optogenetyki: światłoczułe białka, metody ich dostarczania do badanych komórek oraz następnie oświetlania, pokrótce zostaną one omówione poniżej.

Światłoczułe białka

Naturalnie takie białka występują u mikroorganizmów, a pierwsze z nich zostały zidentyfikowane już ponad 40 lat temu. Białka te, wystawione na działanie światła, modyfikują aktywność komórek, w których ulegają ekspresji, a kierunek tej modyfikacji może być zarówno w stronę stymulacji, jak i inhibicji (2). Do pierwszej grupy należy m.in. kanałorodopsyna-2 występująca u alg z rodzaju Chlamydomonas, będąca nieselektywnym kanałem kationowym. Po jej pobudzeniu światłem niebieskim o długości fali 470 nm następuje swobodny przepływ kationów w obrębie błony komórki i miejscowa depolaryzacja, która w przypadku membrany neuronów prowadzi do powstania potencjału czynnościowego. Do drugiej grupy, białek powodujących hiperpolaryzację błony hamującą powstanie potencjału czynnościowego, należy halorodopsyna z Natronomonas pharaonis -pompa chlorkowa, która reaguje na światło żółte (580 nm). Lista białek światłoczułych, którymi dysponują naukowcy, zwłaszcza dzięki wykorzystaniu inżynierii genetycznej, ciągle się powiększa.

Strategie dostarczania genów kodujących białka światłoczułe do specyficznych komórek

Najczęściej wyróżnia się tu trzy podejścia:

1. Użycie wektora wirusowego – w tej strategii tworzony jest konstrukt genetyczny składający się z sekwencji nukleotydowej genu kodującego białko światłoczułe oraz sekwencji tzw. tkankowo – specyficznego promotora, który umożliwia ekspresję genu, czyli przetłumaczenie informacji zawartej w postaci sekwencji nukleotydowej na sekwencję aminokwasową białka. Konstrukt ten zostaje umieszczony w wirusie (szeroko wykorzystywane są lentiwirusy czy też wirusy towarzyszące adenowirusom), który jest następnie wstrzykiwany w obszar mózgu poddawany badaniu. Do tej pory tą technikę stosowano m.in. u myszy, szczura, dania pręgowanego i u naczelnych. Sporym jej ograniczeniem jest pojemność wektora wirusowego, co sprawia, że ograniczona jest liczba typów komórek, które mogą być tym podejściem zmodyfikowane z zachowaniem satysfakcjonującego poziomu ekspresji.
2. Zwierzęta zmodyfikowane genetycznie – u  których samoistnie (bez udziału wektora wirusowego) dochodzi do ekspresji białek światłoczułych w wybranych populacjach komórek. Jednak stworzenie ustabilizowanej linii zwierząt zmodyfikowanych genetycznie wymaga zarówno wiele czasu, jak i pracy, a w przypadku chęci wykorzystania innego białka światłoczułego, charakteryzującego się innymi właściwościami, konieczne każdorazowo wytwarzanie nowej linii.
3. Połączeniem dwóch powyższych strategii i jednocześnie dominującym obecnie podejściem, jest wykorzystanie myszy, które w wybranych komórkach posiadają enzym rekombinazę Cre, katalizujący rekombinację (wymianę) sekwencji DNA zawartej między dwoma sekwencjami loxP. Wektor wirusowy, zawierający odwróconą sekwencję kodującą białko światłoczułe, zawartą pomiędzy dwoma sekwencjami loxP, jest dostarczany do regionu mózgu, który ma być analizowany. Tylko te komórki, które posiadają rekombinazę Cre, są w stanie wytwarzać białka światłoczułe. Dzięki temu na danej linii myszy można przeprowadzać eksperymenty z wykorzystaniem różnych rodzajów białek, gdyż wymaga to jedynie dostarczenia nowego wektora wirusowego.

Ukierunkowane oświetlanie

Do oświetlania komórek zawierających światłoczułe białka stosuje się jako źródło światła lasery bądź diody elektroluminescencyjne (LED). Szerokie zastosowanie znalazły przede wszystkim lasery, ponieważ pozwalają na użycie wąskiego pasma światła, można je również łatwo połączyć ze światłowodem. Światłowody umożliwiają dotarcie do pożądanego regionu wewnątrzczaszkowego, a dodatkowo ich niewielka średnica (~200 µm) minimalizuje uszkodzenia tkanek. Z kolei LED-y wymagając relatywnie niższych nakładów finansowych, problemy rodzi jednak łączenie LED-ów ze światłowodami – obserwowana jest ich niska wydajność, a także niekorzystne generowanie ciepła. LED-y są szczególnie wykorzystywane w przenośnych bezprzewodowych urządzeniach optogenetycznych (2).

Podsumowanie

Optogenetyka, przez wybiórczą aktywację danej grupy komórek u zwierząt swobodnie się poruszających, umożliwia badanie funkcji układów czynnościowych mózgu, a także poszukiwanie przyczyn leżących u podstaw takich zaburzeń jak choroba Parkinsona, Alzheimera, Huntingtona, schizofrenia czy epilepsja, wykorzystuje się ją także w badaniach nad nastrojem, uzależnieniami czy odczuwaniem bólu (3). Wraz ze wzrastającą liczbą zmodyfikowanych białek światłoczułych, reagujących coraz szybciej i na coraz większy zakres fal świetlnych, rozwijaniem lepszych modeli zwierzęcych, tworzeniem skuteczniejszych metod ukierunkowanego oświetlania badanych komórek, powstaje szansa na coraz pełniejsze zrozumienie rozmaitych procesów chorobowych, a co za tym idzie – na ich skuteczniejsze leczenie.

Na podstawie:

Guru A, Post RJ, Ho YY, Warden MR. Making Sense of Optogenetics.  Int J Neuropsychopharmacol. 2015, 18(11):pyv079.

Literatura:

1. Deisseroth K. Optogenetics. Nat Methods. 2011, 8(1):26-9.
2. Deisseroth K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nat Neurosci. 2015, 18(9):1213-25.
3. Vann KT, Xiong ZG. Optogenetics for neurodegenerative diseases. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 2016, 8(1):1-8.