Dzięki badaniom nad właściwościami komórek macierzystych hodowla mózgu w probówce przestaje być już tylko nośnym hasłem rodem z powieści science-fiction. Przedmiotem tego opracowania będzie artykuł przeglądowy Masona i Price’a z 2016 roku na temat możliwości płynących z hodowli tzw. organoidów czyli miniaturowych struktur przypominających organy. Jest to zagadnienie o tyle interesujące, że niesie za sobą obiecujące i mniej kontrowersyjne niż dotychczas możliwości modelowania rozwoju tkanki mózgowej. Zanim jednak o tym, przyjrzyjmy się procesom formowania się tkanki nerwowej u zarodka.

Rozwój kory mózgowej - mysz vs. człowiek

Na najbardziej podstawowym poziomie możemy mówić o tym, że układ nerwowy rozwija się z ektodermy - jednego z trzech listków zarodkowych embrionu - która w procesie neurulacji wytwarza cewę nerwową. To właśnie z niej w toku dalszego rozwoju powstaje ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy. Na wczesnym etapie cewa nerwowa składa się ze strefy przykomorowej (ventricular zone, VZ) oraz brzegowej (marginal zone, MZ) - zewnętrznej. W strefie przykomorowej zachodzi z kolei proliferacja, czyli intensywne namnażanie się komórek. Znajdujące się tam niezróżnicowane progenitorowe komórki śródbłonka (intermediate progenitor cell, IPC) mają zdolności przekształcania się zarówno w neurony, jak i komórki glejowe. Spośród tych ostatnich szczególną rolę w rozwoju pełnią komórki gleju radialnego (radial glial cell, RGC), które stają się swego rodzaju rusztowaniem, po którym wspinają się nowo powstające neurony. Neurony migrują po wypustkach gleju, przechodząc ze strefy przykomorowej „ku górze” i tworząc warstwy kory mózgowej. Oznacza to, że im wcześniej w rozwoju powstała dana komórka, tym znajduje się w bardziej wewnętrznej warstwie kory (Longstaff, 2012).

Na tym etapie można zauważyć jedną z różnic pomiędzy rozwojem kory mózgowej myszy i człowieka. Tworzenie się kory mózgowej myszy jest procesem sporo krótszym. U naczelnych komórki progenitorowe namnażają się szybko i asymetrycznie, powodując przyrastanie cewy nerwowej, która w efekcie staje się „grubsza” niż mysia. Rozwój kory mózgowej myszy trwa od 10 do 18 dnia od poczęcia, natomiast u człowieka rozpoczyna się 35 dnia i trwa przez 3 miesiące. Różnic można dopatrywać się także w specyficznych gatunkowo wzorcach ekspresji genów i rodzajach czynników transkrypcyjnych, dzięki którym różnicowanie się komórek progenitorowych jest w ogóle możliwe.

Cechą wspólną dla kory mózgowej człowieka i myszy jest natomiast jej warstwowa struktura, a także podział na regiony różniące się od siebie pod względem struktury i właściwości chemicznych.

Badania in vitro

Można się zastanawiać, czy opisane wyżej rozbieżności wystąpią także w badaniach in vitro prowadzonych na hodowlach komórkowych. W badaniach tego typu wykorzystuje się głównie dwa rodzaje komórek: zarodkowe komórki macierzyste (embryonic stem cell, ESC) oraz indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (induced pluripotent stem cell, iPSC), które pobierane są z dojrzałych tkanek i nie wymagają niszczenia zarodków (Takahashi i Yamanaka, 2006). W tradycyjnych „dwuwymiarowych” hodowlach komórkowych rzeczywiście udało się otrzymać komórki charakterystyczne dla wszystkich sześciu warstw kory, jednak nie tworzyły one laminarnej struktury, co jest sporym problemem, ponieważ brak jest przestrzennej organizacji strukturalnej warunkującej określone właściwości kory.

Przepis na mózg ze szkiełka

W ten sposób dochodzimy do momentu, w którym na scenę wkraczają zapowiadane od dłużej chwili organoidy. Ich innowacyjność, w porównaniu do opisanych wyżej metod, polega na tym, że składają się ze zróżnicowanych komórek, a dodatkowo są zorganizowane przestrzennie w sposób do złudzenia przypominający organizację tkanek embrionalnych. Można je uzyskać hodując według określonego protokołu pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzenia np. jelitowego. Korowe organoidy agregują się spontanicznie tworząc trójwymiarowe struktury, a do hodowli dodawana jest także zewnątrzkomórkowa macierz, która stanowi otoczkę dla tak zorganizowanej struktury.

Otrzymane w ten sposób modele posiadają właściwie większość cech charakterystycznych dla rozwijającego się układu nerwowego. Zidentyfikowano tu m.in. formacje komórek progenitorowych położonych w warstwach głębokich oraz młodych neuronów usytuowanych bliżej powierzchni. Opisano też występowanie komórek gleju radialnego, a korelacja ilości czynników transkrypcyjnych dla neuronów organoidu oraz prawdziwego embrionu oscyluje na poziomie 0,9. Co szczególnie ciekawe w badaniach neurofizjologicznych udało się też wykazać spontaniczny napływ jonów wapniowych do komórki, którego częstość wzrastała po dodaniu do hodowli glutaminianu, co stanowi dowód na to, że organoidy mają na swojej powierzchni sprawne receptory dla neuroprzekaźników.

Organoidy w badaniach

Wykorzystanie organoidów może być bardzo użyteczne w zrozumieniu podłoża neuronalnego zaburzeń rozwojowych. Za pomocą techniki CRISPR-Cas9 można w relatywnie łatwy sposób, przez cięcie DNA i wprowadzanie nowej wersji genu, dokonać modyfikacji na komórkach progenitorowych. Poza tym możliwe jest również wytwarzanie organoidów z komórek pacjentów cierpiących na dane zaburzenie rozwojowe. Dzięki tego typu manipulacjom udało się m.in. stwierdzić, że w organoidach stworzonych z komórek macierzystych pacjentów z diagnozą zaburzeń ze spektrum autyzmu dochodzi do nadprodukcji interneuronów GABA-ergicznych. Zlokalizowano także czynnik transkrypcyjny FOXG1 odpowiedzialny za wzmożoną produkcję tych komórek, który tym samym może odgrywać dużą rolę w rozwoju autyzmu (Mariani i in., 2015). Innym ciekawym odkryciem jest obserwowanie organoidów stworzonych z komórek infekowanych wirusem ZIKA. Na tej podstawie wykazano np., że taka infekcja prowadzi do zwiększenia śmierci komórkowej i zmniejszenia intensywności proliferacji, a organoid zainfekowany wirusem osiąga mniejsze rozmiary w porównaniu z nieinfekowanym (Garcez i in., 2016). 

Użycie organoidów do badań jest interesującą i obiecującą metodą. Warto jednak pamiętać, że jak każdy model nie jest on wolny od ograniczeń. Jednym z głównych jest fakt, że rozwijający się naturalnie zarodek nie znajduje się w izolacji, ale rozwija się w towarzystwie innych narządów i systemów jakim jest chociażby unaczynienie, czego brak jest w przypadku organoidów.

Bibliografia:

1.      Longstaff, A. (2012). Krótkie wykłady. Neurobiologia. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN.

2.      Mason, J. O., Price, D. J. (2016). Building brains in a dish: Prospects for growing cerebral organoids from stem cells. Neuroscience, 334, 105-118.